胰酶消化法培養平滑肌細胞
1.1　試劑和動物
胰酶購自Sigma公司；α-actin抗體購自上海恒遠生化有限公司；PBS液各成分均為市售分析純；新生小牛血清購自HyClone；DMEM 為Gibco產品。雄性Wistar大鼠（2只，體重175±25 g）購自中國醫學科學院實驗動物中心。
1.2　胰酶消化法原代培養
Wistar大鼠處死，迅速取出胸主動脈，浸泡在含無菌PBS的表面皿中，轉移到無菌超凈臺。在表面皿中漂洗主動脈去除殘留的血跡，縱向剪開主動脈，把主動脈鋪平并使內膜朝上，用鑷子來回刮除內膜層，剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mm×1 mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養瓶中于37℃條件下消化。當在顯微鏡下觀察組織塊表面出現大量細胞時應立即加入血清終止消化，一般消化的時間在 3.5 h。終止消化后將玻璃培養瓶置于37℃空氣搖床振搖10 min，繼續用吹打的方法使組織塊表面的細胞盡可能脫落。待細胞從組織塊脫離后，120目細胞篩過濾，轉入離心管內離心，棄上清，用含20%小牛血清的 DMEM培養基吹打細胞，zui后接種于25 mL培養瓶，放入CO₂孵箱培養，48 h后換液。
1.3　傳代培養
細胞融合后，倒去舊的培養液，加入適量的0.25%胰酶，顯微鏡下觀察，見細胞收縮后去除消化液，加入適量培養液，吹打細胞，以1∶2接種于新培養瓶中，補足培養液，放入37℃、5%CO₂孵箱培養。傳代細胞從第三代開始可換用含10%小牛血清的DMEM培養基培養。VSMC 至少可以傳16代以上，并且從第二代開始平滑肌細胞即可凍存。
1.4　動脈平滑肌細胞的鑒定

相差顯微鏡下，細胞未匯合之前多數呈梭形，至匯合后，部分區域細胞束狀排列，呈典型的“峰和谷”狀態。將傳代獲得的平滑肌細胞接種于蓋玻片上，3~4天后至亞匯合狀態，取出細胞爬片，PBS清洗后用4℃純丙酮固定15~30 min，自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌動蛋白抗體免疫組織化學染色鑒定VSMC肌動蛋白。根據S-P免疫組織化學染色的常規方法，以平滑肌細胞胞漿棕黃色為陽性結果。
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